对虾偷死野田村病毒(CMNV)RTPCR检测方法建立,本论文为您写对虾毕业论文范文和职称论文提供相关论文参考文献，可免费下载。
对虾论文参考文献：
摘 要：参考 GenBank 中对虾偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus, CMNV）的基因序列,应用 Primer Premier5.0 软件设计了一对引物,建立了适合CMNV快速检测的RT-PCR检测方法.以该方法对实验室分离并保存的CMNV cDN*段为模板进行PCR扩增,得到了预期大小为210bp的目的片段.将扩增所得的DN*段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的CMNV的相应序列比对分析,确定为CMNV的基因序列.以对虾常见IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）、WSSV（对虾白斑综合症病毒）、TSV（桃拉病毒）、YHV（黄头病毒）等病毒核酸片段为模板,用设计的引物进行PCR,结果均为阴性.该方法敏感性检测结果表明,最低RNA模板检出量为2pg.表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于对虾CMNV的快速检测.
关键词： 虾 ； 病毒 ；检测方法
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
从宁波市多个南美白对虾育苗场分别采集10日龄虾苗幼体1000尾左右,95%酒精保存,CMNV、IHHNV（传染性皮下及造血组织坏死病毒）、WSSV（对虾白斑综合症病毒）、TSV（桃拉病毒）、YHV（黄头病毒）阳性样品为本实验室的保存样品.上海生工的“柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒”和“胶回收纯化试剂盒”、康为世纪“HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒”、 康为世纪“2×Taq MasterMix”.
1.2 病毒RNA提取
根据上海生工的柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒,操作如下：
将阳性虾苗用RNase-free研磨器研磨匀浆后,取25-50mg匀浆产物加入1.5ml RNase-free离心管中,加入450μl Buffer Rlysis-AG,立即震荡混匀,室温放置3min；12,000rpm,4℃离心3min,将上清移至新的1.5ml RNase-free离心管中,加入1/2体积无水乙醇,充分混匀后,转移至吸附柱中,静置1min,室温12,000rpm离心1min,倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中,加入500μl GT solution,静置1min,室温10,000rpm离心1min,倒掉收集管中废液；再加入500μl NT Solution,静置2min,室温10,000rpm离心1min,倒掉收集管中废液；室温12,000rpm空转离心2min；将吸附柱放入新的RNase-free的离心管中,在吸附膜*加入40μl DEPC处理的水,静置2min,室温12,000rpm离心2min,得到总RNA.
1.3 引物设计
参考 GenBank 中收录的CMNV序列,经比对分析后用 Primer premier 5.0 软件设计一对特异性引物,引物序列如下：
正向引物：C M N V - F ： 5’-GCCACAACCGAGTCAAACC-3’
反向引物：C M N V - R ： 5’-CTGCTAAAGGGACGGAAGG-3’
预扩增片断长度为 210 bp,引物由北京六合华大基因科技有限公司合成.
1.4 RT-PCR
根据康为世纪的“HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒”操作,配制反应体系,总体积20μl.42℃孵育30-50分钟,85℃孵育5分钟.反应结束后,逆转录产物可直接用于后续PCR,或置于-20℃长期保存.
PCR反应条件为：94℃,4min,再开始35次循环（变性94℃, 30s；引物退火58℃, 30s； 延伸72℃,30s）,然后72℃下延伸5min,最后4℃保温.PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳紫外观察, 并对扩增片段210bp的条带进行胶回收纯化, 纯化的 PCR产物送上海英骏生物技术有限公司完成测序,序列通过NCBI的BLASTN进行比对, 验证PCR产物的准确性.
1.5 特异性试验
以CMNV、IHHNV、WSSV、TSV、YHV、正常虾苗等的 RNA 或 DNA 按相同条件进行RT-PCR或PCR 扩增,进行特异性检验.
1.6 敏感性试验
核酸蛋白检测仪测定CMNV基因组总RNA,确定RNA的浓度,并将提取的RNA依次做10倍梯度稀释,按1.4节所述的条件进行RT-PCR扩增以检测其敏感性.
2 结果
2.1 RT-PCR扩增和产物验证
将CMNV的 RT-PCR 扩增产物于1.5% 琼脂糖凝胶上电泳, 结果表明扩增产物大小均约为210 bp,与预期结果相符,正常对虾作对照,未检出目的条带.
2.2 序列测定及分析
序列测定结果表明 PCR 扩增片段长度为210 bp,将测序所得结果与GenBank中的CMNV 相应基因序列进行比对分析,所测片段结果与KM112247相应片段序列一致,确定为CMNV基因序列.
2.3 特异性试验
采用建立的 RT-PCR 方法能够从CMNV阳性的虾苗中扩增出210bp的单一目的条带,IHHNV、WSSV、TSV、YHV、正常虾苗均为阴性.
2.4 敏感性试验
用核酸蛋白检测仪测定得到CMNV基因组总RNA浓度为20ng/μL.将提取的RNA依次做10倍梯度稀释,用正反向引物进行RT-PCR扩增,结果显示其敏感性为2pg .
3 讨论
对虾偷死野田村病毒的潜隐性和高致死率引起广大水产工作者和养殖户的关注,如何能够有效、快捷地检测出该病原已迫在眉睫.目前已开始出现一些基于LAMP（环介导等温扩增技术）的试剂盒,但存在一些缺陷,如灵敏度过高,易出现假阳性,试剂盒价钱贵、不易操作等.PCR技术是比较传统且成熟的技术,容易操作,检出率和正确率都比较高.
参考文献：
[1] 徐承旭. 黄海所发现对虾偷死病疑似病原. 水产科技情报, 2015,（01）： 31-32
[2] 李成元, 姚美玲, 王广伟,等. 应用RT-PCR方法检测牛轮状病毒的研究. 中国动物保健, 2015, 17（4）： 75-78
结论：关于对不知道怎么写对虾论文范文课题研究的大学硕士、相关本科毕业论文对虾是淡水还是海水论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料下载。
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