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摘 要：为了建立一个重现性好、稳定性高,适用于海带属ISSR遗传分析的PCR反应体系,从海带属配子体材料中提取基因组DNA作为模板,应用正交设计试验对反应体系中各因子的不同浓度进行组合优化.结果显示：适用于海带ISSR扩增反应的最佳体系（20 μL）为：1×PCR buffer,1.2 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTPs,1.0 μmol/L ISSR引物,40 ng 模板DNA,0.25 U Taq DNA 聚合酶；扩增PCR程序为：95℃预变性3 min；95℃变性45 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,共38个循环；最后72℃延伸10 min.在优化的海带ISSR反应条件下,扩增条带稳定,重现性好,为应用ISSR分子标记技术进行海带属遗传多样性研究和分子鉴定奠定了技术基础.
关键词：海带属；配子体；DNA提取；ISSR；体系优化
中图分类号：Q75 文献标志码：A 论文编号：2013-0938
Genomic DNA Extraction and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Saccharina
Li Yan, Cui Cuiju, Luo Shiju, Li Xiaojie, Zhao Juping, Sai Shan, Qian Rui, Wu Ruina
（Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd/National Alage Project Technology Research Centre/
Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province, Yantai 264003, Shandong, China）
Abstract： In order to establish a reproducible, stable, and suitable reaction system of Saccharina for ISSR analysis of genetic differences, the genomic DNA extracted from gametophytes of Saccharina was used as template, the different concentrations of the factors in reaction system were optimized by orthogonal design experiment. The results showed that, the optimal ISSR reaction system （20 μL） contained 1 ×PCR buffer, 1.2 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTPs, 1 μmol/L ISSR primer, 40 ng template DNA and 0.25 U Taq DNA polymerase. The PCR program was pre-denatured at 95℃ for 3 min and followed by 38 cycles of 45 s at 95℃, 45 s at 52℃, 2 min at 72℃, and final extension of 10 min at 72℃. The optimal ISSR reaction system was stable and repeatable. This system could provide the technical foundation for the application of ISSR molecular marker technology for the study on genetic diversity and molecular identification of Saccharina.
Key words： Saccharina； Gametophyte； DNA Extraction； ISSR； System Optimization
0 引言
海带（Saccharina japonica）属于褐藻门（Phaeophyta）、海带目（Laminariales）、海带科（Laminariaceae） 、海带属（Saccharina）藻类,19世纪20年代从日本首次引进,并逐渐适应中国海域条件,现在是中国人工栽培历史最长、产量最高的大型经济海藻,在医药、食品、化工等方面都有广泛的应用[1-2].近年来,中国又陆续引进了多个海带种类如Saccharina longissima、 Saccharina angustata、Saccharina ochotensis、Saccharina religiosa等丰富了海带种质资源,也为开展遗传育种和新品种杂交选育工作提供了材料[3-4].海带的分子遗传学方面的基础研究开展较晚,目前针对海带遗传多样性研究的报道中主要以SSR、RAPD标记技术为主[5-6].ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat,简单重复间序列）是在1994年由Ziekiewicz等[7]在SSR标记的基础上开发的一种新的分子标记,和SSR标记相比,ISSR不需要预先知道基因组的序列信息,也不需要开发引物,成本低、操作简便、反应的遗传多态性丰富.但在使用ISSR标记进行PCR扩增试验时,不同物种的试验材料对引物反应条件的要求也不同,因此需要对引物进行筛选和反应体系的优化.邵峰等[8]采用高盐低pH法提取紫色观赏辣椒的基因组DNA,并通过正交设计试验优化了ISSR-PCR反应体系；陈名红等[9]采用单因素试验对影响百合ISSR-PCR反应体系中的6个主要因素进行优化筛选,建立了适合百合属的ISSR最佳反应体系；汪斌等[10]筛选出适合红麻的ISSR引物,进行了体系优化,并利用ISSR扩增条带建立了6份红麻种质材料的指纹数据库；王新宇等[11]用ISSR分子标记技术构建了多态性水平较低的小麦种内指纹图谱,能将亲缘关系很近的品种或品系区分开.目前,ISSR已被广泛应用于物种的系统发育,品种鉴定和遗传多样性研究[12-14],目前在国内,沈永宝等[15]、陈海云等[16]是利用ISSR分子标记技术在种质鉴定方面做得较好的专家.在海带属的分子标记技术研究中,尚未见有对ISSR反应体系优化的相关报道,因此本研究以海带配子体的基因组DNA为模板,应用正交设计试验对海带ISSR-PCR反应体系进行优化,为后续开展海带品种鉴定和遗传多样性研究奠定基础.
结论：适合配子体论文写作的大学硕士及相关本科毕业论文，相关配子体名词解释开题报告范文和学术职称论文参考文献下载。
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